Biología

Tinción diferencial: Tinción de Gram

TINCIÓN DE GRAM … (RESOLUCIÓN OIV/OENO 206/2010)
Objetivo: 
La tinción de Gram se usa para diferenciar las lactobacterias (grampositivas) de las acetobacterias (gramnegativas), además de observar su morfología.
Comentarios
Cabe recordar que la tinción de Gram no basta para extraer conclusiones, dado que puede haber otras bacterias además de las lácticas y las acéticas.
Principio:
Este color se basa en la diferencia de estructura y composición química de las paredes celulares de las bacterias grampositivas y gramnegativas. Las paredes celulares de las gramnegativas, ricas en lípidos, tienen muy poca cantidad de peptidoglicano. Esto permite la penetración de alcohol y la eliminación del complejo violeta de genciana-iodina, dejando la célula sin color, que se vuelve a teñir de rojo con safranina. En cambio, las paredes celulares de las bacterias grampositivas contienen mucho peptidoglicano y una baja concentración de lípidos. Ello hace que la gruesa pared de peptidoglicano y la deshidratación provocada por el alcohol no permitan la eliminación del color violeta o azul oscuro del complejo violeta de genciana-iodina.

La técnica de tinción de Gram admite varias modificaciones. Pierde su utilidad cuando se realiza en un cultivo demasiado antiguo. Por ello la bacteria tiene que estar en una fase de crecimiento exponencial en 24 a 48 horas.

Soluciones:
El agua que se use tiene que ser destilada.
1. Solución de violeta de genciana
Preparación: Pese 2g de violeta de genciana (o violeta cristal), póngalos en un matraz Erlenmeyer de 100 ml y disuélvalos en 20 ml de alcohol al 95%. Disuelva 0,8g de oxalato de amonio en 80 ml de agua destilada. Mezcle las dos soluciones y use la mezcla una vez hayan transcurrido 24 horas. Fíltrela con papel cuando la vaya a usar. Manténgala lejos de la luz, en un matraz oscuro.
2. Solución Lugol:
Preparación: Disuelva 2g de yoduro potásico en una cantidad mínima de agua (4 a 5 ml) y disuelva 1g de iodina en esta solución saturada. Aumente el volumen hasta 300 ml con agua destilada. Manténgala lejos de la luz, en un matraz oscuro.
3. Solución de safranina:
Preparación: Pese 0,5g de safranina en un matraz Erlenmeyer de 100 ml, disuelva con 10 ml de alcohol al 95% y añada 90 ml de agua. Remueva. Manténgala lejos de la luz, en un matraz oscuro.
Preparación:
Preparación de la muestra
Partimos de un cultivo de bacterias  en un medio líquido o sólido. Tome una pequeña cantidad de las bacterias del cultivo joven (después de centrifugar el cultivo líquido) o directamente del medio sólido con una espiral o con una varilla y mezcle una gota del agua esterilizada.
Ponga la muestra sobre un portaobjetos, esparciendo una gota de la suspensión microbiana. Deje que se seque la muestra y fíjela, pasando rápidamente el portaobjetos tres veces por la llama de un mechero de Bunsen o equivalente. Cuando se haya enfriado, proceda con la tinción.
Tinción
Vierta unas pocas gotas de solución de violeta de genciana en la muestra fija. Deje que reaccione durante 2 minutos y lave con agua.
Vierta una o dos gotas de solución Lugol. Deje que reaccione durante 30 segundos. Lave con agua y seque con papel de filtro.
Vierta alcohol al 95% y deje que actúe durante 15 segundos. Enjuague con agua y seque con papel de filtro.
Vierta unas pocas gotas de solución de safranina y deje que actúe durante 10 segundos. Lave con agua y seque con papel de filtro.
Ponga en la muestra una gota de aceite de inmersión.
Con el objetivo de inmersión, observe a través del microscopio en campo claro.
Resultados:
Las lactobacterias quedan de color violeta o azul oscuro (grampositivo). Las acetobacterias quedan de color rojo (gramnegativo).
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